De gescheiden Larry Daley heeft altijd pech. Maar wanneer hij met enige tegenzin een baan als nachtbewaker in het Natural History Museum van New York accepteert, zou hij wel eens een cruciale rol in de wereldgeschiedenis kunnen gaan spelen. Want 's nachts gebeuren er wel heel eigenaardige dingen in het museum: iedereen en alles komt tot leven! Larry zal de samenzwering binnen het museum op moeten lossen om ervoor te zorgen dat de deuren niet voorgoed zullen sluiten.